Nouveaux modes de régulation des voies MAP kinase eucaryotes par phosphorylation

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Inactivation de la MAP kinase atypique ERK4 via la délétion du gène Mapk4 murin

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle physiologique de la MAP kinase atypique ERK3 : analyse génétique et étude de l'expression génique chez la souris

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’importance de la coopération de TRAF1 et LSP1 en aval du récepteur 4-1BB(CD137) pour la survie des lymphocytes

4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqué dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protéine adaptatrice qui est recrutée par 4-1BB et autres TNFRs et est caractérisée par une expression très restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules épithéliales. TRAF1 est nécessaire pour l’expansion et la survie des cellules T mémoire en présence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk impliquée dans la régulation de la molécule pro-apoptotique Bim. Suite à l’activation du récepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqués dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. L’activation et la régulation de TRAF1 et Bim ont un rôle important dans la survie des cellules T CD8 mémoires. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratégie, nous avons identifié que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recruté dans le complexe de signalisation 4-1BB de manière TRAF1 dépendante. Une caractérisation plus poussée de l’interaction entre TRAF1 et LSP1 a montré que LSP1 lie la région unique N-terminal de TRAF1 de façon indépendante de la région conservée C-terminal. À l’instar des cellules T déficientes en TRAF1, les cellules T déficientes en LSP1 ne sont pas capables d’activer ERK en aval de 4-1BB et par conséquent ne peuvent pas réguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB dans le but d’activer ERK et réguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littérature, le récepteur 4-1BB n’est pas exprimé à la surface des cellules B murines, mais le récepteur 4-1BB favorise la prolifération et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'étudier l'expression du récepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modèle murin et de prédire la réponse clinique à la manipulation de 4-1BB. En utilisant différentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifié que le récepteur 4-1BB est exprimé à la surface des cellules B de souris suite à une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractérisation plus poussée a montré que le récepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manière dépendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a démontré que la stimulation avec le LPS induit l’expression du récepteur 4-1BB à la surface des cellules B murines, menant ainsi à l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manière similaire aux cellules T. Les cellules B déficientes en TRAF1 et les cellules B déficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau d’expression du récepteur significativement diminué comparé aux cellules B d’une souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont nécessaires pour une expression maximale du récepteur 4-1BB à la surface cellulaire de cellules B murines et coopèrent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.

Rôles de deux corécepteurs impliqués dans le maintien des cellules T mémoires CD8+ et la maturation des cellules dendritiques

La reconnaissance d’un antigène présenté par les cellules présentatrices d’antigène induit la prolifération et la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs et mémoires. Cette reconnaissance se fait par l’interaction du récepteur des cellules T (TCR) des lymphocytes T et le complexe CMH-peptide présent à la surface des DC. Cependant, des signaux additionnels sont requis, une meilleure activation des lymphocytes T implique des corécepteurs présents à la surface de ces deux types cellulaires. Après l’élimination de l’antigène, la plupart des lymphocytes T effecteurs vont mourir. Une petite population de lymphocytes T va persister pour se différencier en lymphocytes T mémoires capables de protéger l’organisme contre une réinfection. Les signaux qui contrôlent le maintien des lymphocytes T mémoires sont encore mal compris. Pour comprendre le rôle de la molécule de costimulation 4-1BB dans le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires, nous avons émis l’hypothèse que l’état de phosphorylation de la protéine adaptatrice TRAF1, qui se lie à 4-1BB, module le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires. Ainsi, nous avons montré par des expériences de spectrométrie de masse que TRAF1 s’associe préférentiellement à TBK1 lorsqu’elle n’est pas phosphorylée. Nous avons aussi montré que la présence de TRAF1 est requise pour stabiliser TBK1 au récepteur 4-1BB après stimulation des lymphocytes T. Par ailleurs, les lymphocytes T CD8 OT-I TRAF1-/- reconstituées avec un mutant phospho-déficient de TRAF1 (S139A) et ensuite différenciées en lymphocytes T mémoires in vitro induisent une activation de la voie de signalisation NF-ĸB contrairement à ceux exprimant la forme phospho-mimétique de TRAF1 (S139D). Ces premières études démontrent l’importance de l’état de phosphorylation de TRAF1 en aval de 4-1BB dans les cellules T. Dans la seconde partie, nous avons évalué le rôle d’un autre corécepteur; la neuropiline 1, dans la maturation des DC. A cet effet, nous avons émis l’hypothèse que l’interaction de la neuropiline 1 et ses ligands contribuerait à la fonction des DC. Nous avons démontré que l’absence de la neuropiline 1 n’a pas d’effet sur la maturation au LPS des DC. Cependant, la présence du VEGF (un ligand de Nrp-1) inhibe la maturation des DC dérivées de la moelle osseuse. Notre étude a démontré que VEGF inhibe l’expression des molécules de costimulation, la sécrétion des cytokines pro inflammatoires et la signalisation TLR4 principalement les voies MAP Kinase et NF-ĸB. Contrairement aux résultats avec les cellules WT, VEGF n’est pas capable d’affecter la maturation, la sécrétion des cytokines et la signalisation TLR4 des DC Nrp1-Lyz où la neuropiline 1 est délétée. Ainsi, nos résultats ont démontré que VEGF inhibe la maturation des DC de façon Nrp1-dépendante. Enfin, l’analyse des molécules partenaires de la neuropiline 1 montre que Nrp1, VEGF et TLR4 se retrouvent dans le même complexe. Nos résultats démontrent que VEGF, en présence de la neuropiline 1 est capable d’interagir avec TLR4 pour inhiber la maturation des DC. Toutefois, en absence de la neuropiline1, VEGF n’est pas capable de recruter TLR4 pour réduire l’expression des molécules de costimulation. Ces études sur les corécepteurs pourraient être importantes dans l’élaboration de nouvelles approches vaccinales.

Caractérisation de l’activité Nur77 et de ses complexes en essais BRET par complémentation

Dans le système nerveux central, la dopamine joue un rôle crucial dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que : l’apprentissage, le mouvement volontaire, la motivation, la cognition et la production hormonale. Il a été aussi démontré que le système de signalisation dopaminergique est altéré dans plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques comme la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Des études, effectuées dans le laboratoire du Dr.Daniel Lévesque (laboratoire d’accueil), ont montré que les récepteurs nucléaires Nur77 (NR4A1, NGFI-B) et RXRγ (retinoid X receptors γ) sont impliqués dans la régulation des effets de la dopamine dans le système nerveux central. De plus, ces données suggèrent que le complexe Nur77 et RXR joueraient un rôle crucial dans l’effet des médicaments antipsychotiques et antiparkinsoniens. Toutefois, très peu de médicaments ciblant Nur77 ont été identifiés à ce jour et les médicaments agissant sur RXRγ restent mal caractérisés. En outre, les analyses actuellement disponibles ne peuvent pas résumer la complexité des activités des NRs et génèrent des mesures indirectes des activités des drogues. Afin de mieux comprendre comment est régulée l’interaction Nur77/RXRγ dans ces processus, mon projet a été de mettre au point un essai BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) et PCA-BRET (Protein Complementation Assay-BRET) basé sur le recrutement d'un motif mimant un co-activateur fusionné avec la YFP. Nos différents essais ont été validés par courbes dose-réponse en utilisant différents composés RXR . Les EC50 (concentration efficace médiane, qui permet de mesurer l'efficacité d'un composé) obtenues étaient très semblables aux valeurs précédemment rapportées dans la littérature. Nous avons aussi pu identifier un composé le SR11237 (BMS649) qui semble posséder une sélectivité pour le complexe Nur77/RXRγ par rapport aux complexes Nurr1/RXRγ et RXRγ /RXRγ. Nos résultats indiquent que ces essais de BRET peuvent être utilisés pour évaluer la sélectivité de nouveaux composés pour les complexes Nur77/RXRγ, Nurr1/RXRγ et RXRγ /RXRγ. Un autre aspect de mon projet de doctorat a été de mettre en évidence par BRET l’importance de la SUMOylation dans la régulation de l'activité de Nur77 dans sa forme monomèrique, homodimèrique et hétérodimèrique. Nous avons ainsi identifié que Nur77 recrute principalement SUMO2 sur sa lysine 577. Il est intéressant de noté que le recrutement de la SUMO2 à Nur77 est potentialisé en présence de la SUMO E3 Ligase PIASγ. Aussi, la perte de la SUMOylation sur la lysine 577 entraîne l'incapacité de Nur77 de recruter divers motifs de co-activation mais pas pour ses formes homo- et hétérodimèrique. Cependant, la présence de PIASγ ne potentialise pas le recrutement du co-activateur, suggérant que cette SUMO E3 Ligase est seulement impliqué dans le processus de recrutement de la SUMO mais pas dans celui du co-activateur. Nous avons ainsi déterminé une nouvelle modification post-traductionnelle sur Nur77 régulant spécifiquement son activité monomérique Ces projets pourraient donc apporter de nouvelles données cruciales pour l’amélioration du traitement de la maladie de Parkinson ou de la schizophrénie, ainsi que d'obtenir une meilleure compréhension sur les mécanismes permettant la régulation de la fonction de Nur77

Effet de la signalisation de ErbB2 et ErbB3 sur l'activité transcriptionnelle des récepteurs des estrogènes et sur la prolifération cellulaire

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.